孕婦外周血中胎兒細胞DNA及法醫學應用前景

很早人們就發現,胎兒的細胞可以進入母體循環中,并在母體外周血中檢測出來。由于人們在不斷尋找無創性的檢測手段來進行產前診斷，孕婦外周血中胎兒細胞的檢測便受到了重視。近年來，隨著分子生物學技術和胎兒細胞分離富集技術的研究進展，可以從孕婦外周血中得到一定比例的胎兒細胞應用于某些基因病診斷。這也為其在法醫學相關領域的應用提供了可能性?，F就該技術的發展及法庭應用前景綜述如下：


1．孕婦外周血中的胎兒細胞和DNA


早在十九世紀末，德國科學家就在死于子癇的孕婦肺組織中發現過滋養細胞。但直到1979年，Herzenberg等[ 1] 才首次應用熒光活化細胞揀選法，在孕15周的HLA-A2陰性孕婦（丈夫為HLA-A2陽性）的外周血中富集出HLA-A2陽性細胞，并用Y染色體熒光標記檢測進行了分析，認為這些細胞來源于胎兒。1989年Lo等[ 2]首次應用巢式PCR技術在孕婦外周血中擴增出Y特異性重復序列，并提出這一技術可以作為性相關基因疾病的產前診斷方法。之后，許多研究都證實了孕婦外周血中存在胎兒細胞和DNA。 
隨著胎兒特異性單克隆抗體的不斷出現和細胞分離技術的發展，人們從孕婦外周血中主要發現了三種胎兒細胞：


滋養細胞（trophoblasts）：Covone等[ 3 ]應用抗H315單克隆抗體，從孕6周及其他孕期的母體外周血中分離出了三類滋養細胞（多核、雙核及來自合體滋養層的無核細胞）。近年，單克隆抗體340也被成功地用于辨認和分離滋養細胞[ 4]。由于在孕第9天形成滋養層細胞的過程就開始了，因而，滋養細胞是胎兒早進入母體循環的細胞;淋巴細胞（lymphocytes）：淋巴細胞在母體外周血中出現較晚，但存活時間可長達分娩后6個月~27年[ 5]，下次妊娠時可再次出現，故被認為不太適合于診斷或鑒定;有核紅細胞（nucleated red blood cell，NRBC）：有核紅細胞在成人血循環中罕見，而在胎兒循環中普遍存在，特別是早孕期，11周時達10%，19周時為0.5%；它有獨特的抗原成分，如轉鐵蛋白受體（CD71）、血型糖蛋白A（GPA）等可被用來分離富集胎兒細胞；其存活壽命短，一般不超過90天，不至于影響下次妊娠的診斷。因此,有核紅細胞被認為是較適于診斷的胎兒細胞。Simpson等用流量細胞計數器分析獲得的數據，胎兒有核紅細胞與母體外周血中的有核細胞之比是1：107~108，Hall等應用免疫純化方法（抗CD34）估計，該比例為1：4.75×106~1：6×107[6] ?？梢?，胎兒細胞在母體外周血中的數量很少。


在母體外周血的血漿中也可以檢測到胎兒的DNA[7]。有學者認為，母體血漿中存在游離胎兒DNA，是因為胎兒對母體就如同腫瘤對機體一樣，腫瘤DNA可以在血漿中檢測到，那么母體對胎兒也會有免疫排斥反應，是胎兒細胞破裂將DNA釋放到母體血漿中所致。


2．孕婦外周血中胎兒細胞、DNA的檢出方法


在染色體水平檢測胎兒細胞,主要是采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH )的方法，診斷18三體、21三體、47，XXY等染色體病，故在此不予贅述。PCR技術在檢測微量胎兒細胞進行基因診斷方面表現出很大的潛力。


擴增母體外周血細胞的DNA 經過富集或未經富集的孕婦外周血，常規方法提取DNA后，用PCR方法擴增胎兒特異性DNA片斷，可檢測到胎兒基因。Lo等[2]用該方法檢測孕婦外周血有核細胞DNA中Y特異重復序列，對9-41孕周的胎兒進行了產前性別鑒定。其方法是：采取靜脈血，常規提取DNA后，振蕩30分鐘使DNA斷裂并將胎兒DNA與母血DNA充分混合；取2ugDNA，以Y1.1和Y1.2為引物,經40循環后，再取擴增產物2ul,以Y1.3、 Y1.4為引物進行15-20個循環的擴增。結果，12名產下男嬰的婦女外周血中均檢出Y特異重復序列，7名產女嬰的婦女均未檢出。Lo等[8]還應用RhD基因特異性引物，從RhD陰性的母體外周血中成功地檢測出了RhD陽性胎兒的基因型。 Camaschella等[9]還曾用孕婦外周血診斷胎兒β-地中海貧血/Hb Hepor病。


擴增母體外周血漿及血清中的DNA檢測胎兒特異序列 Lo等[7]以母體血漿和血清中的DNA為模板，擴增男性胎兒單拷貝序列DNA,即DYS14基因?；痉椒ㄊ牵涸袐D的靜脈血離心,取血清/漿, 99oC加熱5分鐘后離心；取10ul血清/漿為模板，采用引物Y1.7和Y1.8擴增DYS14，60個循環 。結果, 孕12~14周的43名婦女，DYS14在生男孩的孕婦血漿中的檢出率為80%，血清中的檢出率為70%。遲洪濱等[10]用相同的引物，套試擴增孕婦外周血的血漿、血清中的DYS14基因，所報道的檢出率與Lo等基本相同。
可以看出，PCR雖然不是細胞分離技術，但它能檢測到母體血中極少量的胎兒DNA。Lo等[11]采用連續稀釋男性胎兒DNA的方法進行評價，PCR系統可以在300,000個母體細胞中鑒別出1個男性胎兒細胞，因而其在應用孕婦外周血進行胎兒遺傳物質檢測方面，是極其有價值的方法。


3．胎兒細胞、DNA檢出時間


Hamada等[12、13]應用FISH和Y特異片段的擴增，觀察孕婦不同孕期和分娩后外周血中未經富集的胎兒細胞的出現率。他們發現，在懷孕15周以后,所有懷男胎的孕婦FIHS出現陽性信號；懷孕頭三個月，胎兒細胞要少于1：100,000;三個月后逐漸增多,可達到1：10,000左右；產后1天，生男孩的孕婦血液樣本中,Y陽性的細胞出現的平均頻率為1：17,500 ，之后逐漸下降，至產后3個月不能檢出。


Von Koskull等[14]將富集過的有核血細胞，用2,3-bisphosphoglycerate和GPA抗體鑒別胎兒細胞，在6-19孕周的13名孕婦外周血中鑒別出12份樣本中有胎兒細胞，并使用Y探針FISH進行了性別鑒定。


Thomas等[15]用巢式PCR法對30例經體外受精致孕的婦女外周血擴增單拷貝Y 染色體DNA序列。觀察發現，懷男胎的孕婦血中檢出Y 染色體DNA序列的最早胎齡為4周5天，最遲為7周零1天，平均6周+4天。產后8周任何懷男胎的產婦均不能檢出Y 染色體DNA特異序列。同時有5例以前生過男嬰的婦女，此次妊娠有4例產下女嬰，她們的外周血中均未檢出Y 染色體DNA序列，說明在母體血中檢測Y 染色體DNA序列不受前次妊娠的影響。


馬旭等[ 16]同樣采用套式PCR擴增Y 染色體特異鋅指蛋白基因ZFY。經常規提取DNA，模板量為100ng。結果：19例懷男胎的婦女外周血中ZFY的檢出隨胎齡增加，6周時為53%，11周時為68.4%,14周時為95%。


從上面的研究我們可以看出，胎兒細胞和DNA在孕婦外周血中的檢出時間，主要與胎齡有關，但另一方面，樣本是否經過富集、檢驗的方法和試驗條件的調整與檢出也有一定的關系，致使各家結果呈現出一定的差異。


4．孕婦外周血中胎兒細胞的富集


富集（enrichment）技術是指從母體外周血中分離濃縮胎兒細胞的方法。有關研究表明，使用Y 染色體DNA特異序列擴增，對經過CD71和CPA陽性富集的樣本和未經富集的母血樣本進行檢測，前者PCR的檢出率為94%，后者為64% [17]。富集母體外周血可以增加PCR對胎兒細胞的檢出率。在實踐中應用的富集方法主要有：


密度梯度離心（density-gradient centrifugation）用聚蔗糖-泛影酸鈉混合物作分離介質，加入孕婦外周血后離心，提出有核細胞層，其中包括胎兒有核細胞。宋杰等[18]用此法處理懷孕8~40周孕婦的外周血并經擴增Y特異序列來預測胎兒性別。共64名孕婦，33例生男嬰的有28例檢出Y特異譜帶，靈敏度為84.85%，1例生女嬰的婦女檢出Y特異帶,特異度為96.77%，總符合率為90.63%。


流量細胞計數儀（flow cytometry）揀選：采用這種方法，胎兒有核細胞可基于4個參量被富集，即細胞大小、細胞的顆粒程度、轉鐵蛋白受體和細胞表面糖蛋白分子。Price[ 19]最早應用該方法富集了胎兒細胞，并用PCR擴增Y 染色體DNA特異序列進行檢測，12個男胎全部檢出，女胎85%確診。該方法日后被普遍應用，并與其他揀選方法聯合應用。


熒光活化細胞揀選（fluorescence activated cell sorting，FACS ）：其原理是，制備細胞懸液后，將熒光免疫染色抗原標記在胎兒有核紅細胞表面，再經過流量細胞計數儀，將胎兒細胞分離、富集出來。Bianchi等[20]用抗GPA、抗CD36和抗CD71對47名孕婦外周血進行富集，發現單獨用抗GPA或其與抗CD36和抗CD71之一聯用，對性別的診斷均可達到100%。


磁活化細胞揀選（magnetic activated cell sorting，MACS）：在細胞懸液中加入單核細胞抗體與靶細胞結合，再加入連接著IgG抗體的磁珠與單核細胞抗體結合，置于磁場下，便可聚集出靶細胞。如靶細胞為所需要的胎兒細胞，則稱為正相揀選（positive selection）。如果靶細胞為摻雜的污染細胞，留下的為所需的胎兒細胞，則稱為負相揀選（negative selection）。Steele等[17]先進行密度梯度離心，再用MACS，對18ml母體血進行富集，共得到3×104個有核細胞，其中胎兒細胞占10~20個。


電荷流式分離（charge flow separation，CFS）：CFS設備為一個水平槽，其中液體的梯度與電場方向相反。細胞垂直于液體梯度和電場流動，根據細胞表面電荷密度的特點，不同類型的細胞被彼此分離并集中，通過不同的管道進入收集管。Wachtel等[21]應用該設備并經FISH證實，從20ml母體血中分離出2000多個胎兒有核紅細胞。


好的富集技術，可以產生出最大純度為10%的胎兒細胞[17]，但一般情況下，從正常孕婦外周血中得到的胎兒細胞要少于0.1%。因此，改進富集技術是至關重要的。提高胎兒有核細胞比例，不但會提高PCR的準確率，還可能擴大應用孕婦外周血對胎兒進行遺傳分析的領域。


5．法醫學應用前景


法庭科學通過DNA分析技術主要希望解決兩個問題，一是個人識別，二是親子鑒定。早孕期親子鑒定在實際工作中雖不多見，但卻一直是鑒定中的難點問題。應用早孕期活檢絨毛進行親子鑒定是一個可行的辦法[22]，但其歸根結底，是有創性的取材手段，而且需要一定的醫療條件方可開展取絨毛膜手術，因而取材較為困難，應用受到限制。倘若我們能對孕婦外周血中的胎兒細胞進行DNA分析，則可解決這一問題。


臨床工作中，將孕婦外周血中的胎兒細胞應用于產前基因診斷所遇到的主要問題是胎兒有核細胞分離純化困難，應用相關引物或探針只能有效地檢測到母親沒有、胎兒具有的基因或DNA片段，如：Y染色體特異序列或重復序列，以及檢測RhD陰性母親所懷的RhD陽性胎兒基因,使臨床應用受到限制。法醫學應用也是如此。好在，目前法庭DNA分析中，Y染色體多態性位點的發現及分型技術有了長足的進步，已有足夠的Y染色體多態性位點可用于法庭DNA分析和親子鑒定[23~25]，故采用孕婦外周血中的胎兒有核細胞或DNA對男性胎兒進行孕期親子鑒定，在目前來講，應該是可行的。


對女性胎兒的檢測則需要富集一定純度的胎兒有核細胞，如同法醫物證中的混合樣本那洋，若用常染色體STR位點檢測，則可能分析出2-4個基因條帶，以母親非富集血或毛根細胞DNA作對照，可分析出生父基因，因而，對女胎進行父權鑒定也不是不可能的事情。


總的來講，孕婦外周血中胎兒有核細胞在法庭科學中的成功應用有賴于胎兒細胞分離富集技術的發展和檢測方法的改善。




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(作者單位：北京市高級人民法院法醫技術室 100040)